Avaliacao Dos Niveis Soluveis De Podoplanina E Clec-2 Em Pacientes Com Covid-19

A imunotrombose e definida pela ativacao da hemostasia resultante de uma resposta inflamatoria e/ou infecciosa. Recentemente, a via PDPN/CLEC-2 tem se destacado em processos que medeiam a ativacao plaquetaria e a formacao trombotica. Alem disso, alguns estudos em modelos animais sugerem que a via pode desempenhar um papel importante no processo de protecao pulmonar na Lesao Pulmonar Aguda (LPA). Embora o papel da via PDPN/CLEC-2 nao seja totalmente compreendido, evidencias sugerem que ela pode se encaixar como uma nova via no conceito de imunotrombose. O objetivo do estudo foi avaliar os niveis circulantes de PDPN e CLEC-2 em pacientes com COVID-19 e explorar sua relacao com a gravidade da doenca e a ativacao da hemostasia. Foram incluidos 30 pacientes diagnosticados com COVID-19, alem de 30 controles saudaveis, com aprovacao etica (CAAE 36528420.3.0000.5404 e 30227920.9.0000.5404). As medidas de PDPN foram realizadas com kits de ELISA nos momentos D0 e D4 (4degree dia apos a admissao);A dosagem de CLEC-2 tambem foi realizada por ELISA apenas no tempo D0. Os dados clinicos e laboratoriais foram obtidos de prontuarios eletronicos. Para avaliar a expressao de PDPN em celulas pulmonares foi realizada uma analise "in silico" de scRNAseq. O tempo medio de permanencia hospitalar (LOS) foi de 12,9+/-9,8 dias, doze pacientes (40%) necessitaram de UTI com tempo medio de UTI de 6,1+/-9,7 dias. O D-dimero medio foi de 3,609+/-14,440 ng/mL. A dosagem de PDPN foi menor em pacientes com COVID-19 quando comparada a individuos saudaveis (p<0,0001), e a dosagem de CLEC-2 nao mostrou diferenca entre os grupos. Houve correlacao da PDPN com hemostasia e marcadores de gravidade, tais como: D-dimero (R= -0,529), RNL (R= -0,481), fibrinogenio (R= -0,401) e vWF (R= -0,513). Em relacao aos dados clinicos, os niveis de PDPN estavam mais diminuidos no grupo que necessitou de UTI (p=0,04). Alem disso, dados "in silico" de scRNAseq mostram uma diminuicao de PDPN no tecido pulmonar em pacientes COVID-19 quando equiparados a individuos saudaveis. Recentemente, estudos "in vivo" realizados em modelos animais destacam a via PDPN/CLEC-2 como importante no processo de protecao pulmonar frente a LPA, que ocorre devido a ligacao da CLEC-2 oriunda do complexo plaqueta-neutrofilo a PDPN expressa por macrofagos alveolares, esta ligacao promove a inibicao de citocinas/quimiocinas locais, reduzindo o estado inflamatorio local. Atualmente, nenhum trabalho avaliou a via PDPN/CLEC-2 na COVID-19, sendo um modelo interessante onde ha ativacao da hemostasia concomitante a lesao pulmonar, assim nossos resultados supoem que a via possa estar envolvida no processo de protecao pulmonar, uma vez que a diminuicao da PDPN na COVID-19 foi correlacionada com hemostasia e marcadores de gravidade. Copyright © 2022

MICROVESÍCULAS CIRCULANTES EM PACIENTES COM COVID-19 E SUA RELAÇÃO COM A GRAVIDADE DA DOENÇA E ATIVAÇÃO DA HEMOSTASIA

Objetivos: A ativação da hemostasia é um elemento crítico da patogênese da Covid-19. Microvesículas (MVs) são partículas de bicamada lipídica liberadas de diferentes células e que medeiam a tromboinflamação. Ademais, MVs já se mostraram ser biomarcadores relevantes em outras doenças infecciosas, incluindo pneumonias virais. Dessa forma, os objetivos desse estudo foram quantificar as MVs circulantes originadas de plaquetas, células endoteliais e eritrócitos;avaliar sua atividade pró-coagulante dependente de fator tecidual (APC-FT) e explorar sua relação com marcadores hemostáticos e desfechos clínicos na Covid-19. Material e métodos: Amostras de pacientes com Covid-19 internados devido a necessidade de oxigenoterapia foram coletadas em até 24h do diagnóstico, como parte de um estudo clínico. As amostras usadas neste estudo foram obtidas antes de qualquer intervenção terapêutica. MVs foram extraídas de plasma livre de plaquetas por ultracentrifugação, quantificadas por citometria de fluxo e a APC-FT foi determinada por meio de ensaio coagulométrico de um estágio. Marcadores de ativação da hemostasia foram quantificados por métodos imunológicos ou funcionais conforme indicados. Resultados: Foram incluídos 30 pacientes e 30 indivíduos saudáveis pareados por idade e sexo. O tempo médio de internação (TI) foi de 2,9±9,8 dias, 12 pacientes (40%) necessitaram de cuidados intensivos (UTI) e 28/30 pacientes sobreviveram. As contagens totais de MVs de plaquetas e células endoteliais estavam aumentadas em pacientes comparado com controles, ao passo que entre as MVs com expressão de fator tecidual (FT), apenas as de origem endotelial estavam aumentadas. A APC-FT mostrou-se aumentada em pacientes quando comparado com controles (p = 0,0007). Não observamos associações significativas entre as contagens de MVs ou APC-FT com desfechos clínicos como tempo de internação e tempo de UTI. Em contraste, observamos correlações significativas envolvendo MVs e outros marcadores de ativação da hemostasia a saber tais como MVs (totais) derivadas de plaquetas com fibrinogênio, F VIII:C, FVW e uPAR solúvel, e MV (FT+) derivadas de células endotelial com FVIII:C e FVW. Discussão e conclusão: O entendimento dos mecanismos pelos quais a hemostasia é ativada na Covid-19 é fundamental para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes contra esta e outras doenças infecciosas associadas a aumento de eventos tromboembólicos e imunotrombose. Nossos resultados mostram que a Covid-19 moderada e grave se associa a aumento da contagem de MVs, e que uma fração destas MVs se associa a ativação da hemostasia. Novos ensaios para avaliação funcional da APC-FT serão necessários para definir a associação destes parâmetros com desfechos de gravidade na Covid-19.

AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE MARCADORES DA VIA HEME/HEMOPEXINA/HEME-OXIGENASE 1 E SUA ASSOCIAÇÃO COM PARÂMETROS CLÍNICOS E LABORATORIAIS NA COVID-19

Objetivos: A heme-oxigenase 1 (HO-1) é uma enzima intracelular cuja expressão é fortemente induzida por estímulos como inflamação, infecção e hemólise, e que compõe uma resposta anti-inflamatória e antioxidativa ampla, relevante para a proteção e homeostase celular em diversas condições patológicas. Sua ação específica consiste no metabolismo intracelular do heme em ferro, biliverdina e monóxido de carbono, após a captura do heme livre pela hemopexina (HPX) no meio extracelular, e a translocação deste complexo para dentro do hepatócito. Embora sugestões iniciais de uma ação direta do SARS-CoV-2 sobre a hemoglobina ou o heme já tenham sido refutadas, a ativação da HO-1 é reconhecida como parte da resposta do hospedeiro e como potencial alvo terapêutico em diversas doenças envolvendo trombose e inflamação. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os níveis circulantes de hemopexina, heme e heme-oxigenase 1 na Covid-19, e avaliar a associação destes parâmetros com marcadores tromboinflamatórios e desfechos clínicos relevantes. Material e métodos: A população deste estudo consistiu em 30 pacientes com diagnóstico confirmado de Covid-19 e indicação de internação hospitalar devido a hipoxemia. O grupo controle consistiu em 30 voluntários saudáveis pareados por sexo, idade e região geográfica. A dosagem dos níveis de HO-1 e HPX foi realizada por método imunoenzimático (ELISA) utilizando kits comerciais e os níveis de heme foram medidos por método colorimétrico. A dosagem de marcadores de ativação da hemostasia foi feito por kits comerciais específicos. Resultados: Pacientes com Covid-19 apresentaram níveis aumentados de HO-1 quando comparados com controles (5.741 ± 2.696 vs 1.953 ± 612 pg/mL respectivamente, p < 0.0001), assim como uma tendência ao aumento dos níveis de HPX (3.724 ±0.8804 vs 3.254 ±1.022 mg/mL, respectivamente;p = 0.06). Além disso, observamos uma redução nos níveis de HO-1 e HPX da admissão até o 4°dia de internação. Não foram observadas diferenças nos níveis de heme no plasma de pacientes e controles em nenhum dos dois momentos. Além disso, observamos que os níveis de HO-1 na admissão estão positivamente correlacionados com parâmetros da hemostasia como TP, TTPa, fibrinogênio, FVIII:C, FVW:Ag e receptor de uroquinase (u-PAR), mas não apresentam associação evidente com parâmetros clínicos de gravidade. Discussão: Nossos dados descrevem a cinética de variação dos níveis séricos de heme, HPX e HO-1 em pacientes com Covid-19, demonstrando que à semelhança de outras infecções, a Covid-19 também se associa à indução desta via como parte da resposta anti-inflamatória. Não observamos associação entre a magnitude desta indução e a gravidade da Covid-19. Conclusão: A HO-1 pode representar um biomarcador relevante para a Covid-19, mas novos dados são necessários para subsidiar o seu uso como alvo terapêutico para estes pacientes.

AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS CIRCULANTES DE MEDIADORES DA INTEGRIDADE DA BARREIRA ENDOTELIAL NA COVID-19 E SUA RELAÇÃO COM A ATIVAÇÃO DA HEMOSTASIA

Objetivos: a imunotrombose consiste no processo que envolve a ativação concomitante da imunidade inata, hemostasia e endotélio como parte da resposta a patógenos, e vem sendo colocada no centro da fisiopatologia da Covid-19. Um elemento menos explorado da imunotrombose é a ruptura da barreira endotelial (BE), que permite o acesso dos leucócitos aos tecidos inflamados. Entre os reguladores da integridade da BE destacam-se as vias que envolvem a angiopoietina (Ang) 1 e 2 e seu receptor Tie2, e a via do VEGF-A/VE-caderina (VEC). Além deste papel, foi recentemente demonstrado que a ativação da via Ang/Tie2 inibe a ativação endotelial e a expressão de fator tecidual, estabilizando o endotélio no estado quiescente. Neste estudo determinamos os níveis circulantes de mediadores da integridade da BE na Covid-19, e exploramos sua associação com a gravidade da doença, assim como com a ativação da hemostasia através de um painel abrangente de biomarcadores. Materiais e métodos: as amostras foram obtidas de 30 pacientes internados por Covid-19 devido à hipoxemia e achados tomográficos típicos, e recrutados para um estudo clínico (REBEC: U1111-1250-1843). As amostras foram coletadas em até 24h do diagnóstico, antes de qualquer intervenção terapêutica. Os níveis de reguladores da BE foram medidos por métodos imunológicos (Elisa ou multiplex), e o de biomarcadores da hemostasia por kits comerciais específicos. Um grupo de 30 indivíduos saudáveis pareados por idade e sexo foram utilizados como controle. Dados clínicos e laboratoriais foram obtidos dos prontuários digitais. Resultados: o tempo médio de internação foi de 12,9 ± 9,8 dias, e 12 pacientes (40%) necessitaram de UTI. O dímero D médio foi de 3.609 ± 14.440 ng/mL. Os níveis circulantes de todos reguladores da integridade da BE encontraram-se aumentados em pacientes, quando comparado com controles (Ang1: 463.2 ± 194.6 vs 237.4 ± 104.9 pg/mL, p < 0.0001;Ang2: 1.926 (1.275-3.134) vs 1.215 (9-1.444) pg/mL, p < 0.0001;Tie2: 10.753 ± 2.377 vs 8.603 ± 1.851 pg/mL, p < 0.0001 e VEGF-A: 94.7 (73.4-116.0) vs 45.9 (39.7-57.0), p < 0.0001. Além disso, os níveis de alguns destes reguladores se associaram significativamente a desfechos de relevância clínica, a saber: (i) extensão da lesão pulmonar na tomografia: Ang2 e VEGF-A;(ii) tempo de internação em UTI: VEGF-A. Interessantemente, observamos correlações consistentes e significativas entre os níveis de reguladores da BE a proteínas envolvidas na ativação da hemostasia (fibrinogênio, VWF: Ag, uPAR, PAI-1 e P-selectina). Discussão: o interesse no estudo de reguladores da integridade da BE na Covid-19 já se justifica pelo fato de a doença envolver tanto o comprometimento da barreira alvéolo-capilar quanto a ativação da angiogênese, como demonstrado por outros autores. Nossos resultados reforçam a relevância destas vias através da associação observada com desfechos clínicos. Além disso, os resultados mostram pela primeira vez uma associação entre mediadores da integridade da BE e um painel amplo de biomarcadores da ativação da hemostasia, sugerindo um crosstalk entre estas vias na Covid-19, como demonstrado recentemente no contexto da sepse. Conclusões: nossos resultados apontam que a via Ang/Tie2 deve ser considerada um alvo terapêutico atrativo na Covid-19, por representar um elemento central da imunotrombose nestes pacientes.

AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE DA BARREIRA ENDOTELIAL E SUA RELAÇÃO COM AS MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS E LABORATORIAIS NA COVID-19

Objetivos: Os mecanismos fisiopatológicos que determinam a gravidade da Covid-19 estão associados a ativação da hemostasia e da imunidade inata, em um processo coletivamente referido como imunotrombose, e que envolve ativação plaquetária, geração de NETs (do inglês, Nucleo extracelular traps), expressão de fator tecidual, ativação do complemento e ativação endotelial. Um elemento importante da ativação endotelial é a quebra da barreira endotelial (BE), que ocorre para facilitar o acesso de leucócitos aos tecidos, onde contribuem para erradicação dos patógenos. No entanto, a avaliação da integridade da BE é desafiadora, exigindo o uso de modelos celulares. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito do soro de pacientes com Covid-19 sobre a integridade da BE em monocamadas de células endoteliais, e sua correlação com características clínicas da doença. Materiais e métodos: A população do estudo consistiu em 30 pacientes com Covid-19 que apresentavam comprometimento pulmonar confirmado por tomografia de tórax, e necessidade de internação hospitalar por hipoxemia e 30 controles saudáveis pareados por sexo e idade. Os pacientes recrutados fizeram parte de um estudo clínico (REBEC: U1111-1250-1843), e as amostras utilizadas nesta avaliação foram obtidas no momento da internação, antes de qualquer intervenção. Monocamadas de células endoteliais de duas fontes (HUVECs: células de cordão umbilical;HULECs: células endoteliais pulmonares) foram estimuladas com soro de pacientes e indivíduos saudáveis (diluição 15% em meio de cultura) e a integridade da BE foi avaliada por um sensor de impedância celular (ECIS;Eletric Cell-substrate Impedance Sensing System) continuamente por 36 horas. Biomarcadores de gravidade e relacionados à ativação da hemostasia foram avaliados por kits comerciais. Dados clínicos foram obtidos a partir dos prontuários digitais. Resultados: O soro de pacientes com Covid-19 induziu quebra de BE significativamente mais acentuada que o de indivíduos saudáveis em HUVECs nos tempos 15 min (p < 0,01);30 min (p ≤ 0,001);1h (p ≤ 0,0001);2h (p ≤ 0,0001);3h (p ≤ 0,0001);4h (p ≤ 0,01) e 5h (p ≤ 0,05). Estes resultados foram confirmados no modelo de células endoteliais pulmonares (HULECs). A magnitude da quebra apresentou correlação significativa com desfechos clínicos relevantes como tempo de internação total (RS até 0.57) e tempo de UTI (RS = 0,47). Em relação a biomarcadores de interesse na Covid-19, a quebra da BE apresentou correlação significativa com neutrofilia, relação neutrófilo/linfócito, fator de Von Willebrand, fatores IX e XI, fibrinogênio, D-dímero e uPAR (Receptor de Uroquinase). Discussão: Através de um método considerado padrão-ouro para avaliação in vitro da integridade da BE nós demonstramos que componentes presentes no soro de pacientes com Covid-19 são capazes de promover a quebra da BE, e que a magnitude deste processo está relacionada à gravidade desta doença. A correlação com outros marcadores inflamatórios corrobora a conexão entre os mecanismos envolvidos na imunotrombose em pacientes com Covid-19. Conclusão: nossos resultados apontam a quebra da BE como um alvo terapêutico atrativo nestes pacientes.

Circulating Levels of Ang/Tie2 and VEGF-a Pathway Mediators Are Associated with Clinical Severity, Endothelial Barrier Disruption and Coagulation Activation in COVID-19

Background: the pathogenesis of severe COVID-19 involves the deregulated activation of different compartments of immunothrombosis, which are otherwise important for pathogen eradication and tissue repair. Coagulation activation, angiogenesis and alterations of endothelial barrier (EB) are elements of immunothrombosis that have been shown to be involved in the pathogenesis of COVID-19. Angiopoietins (Ang) 1 and 2 and their receptor Tie2 and VEGF-A are well-known pro-angiogenic mediators that, during inflammation also mediate EB disruption. Recently, it has also been demonstrated that the Ang/Tie2 pathway is involved in coagulation activation. Here we explored whether increased levels of angiogenesis/EB regulators (which have been previously associated with disease severity in COVID-19) are also associated with both EB disruption and coagulation activation in this condition. Methods: the study population consisted of 30 patients with COVID-19 confirmed by RT-PCR and presenting typical CT findings admitted due to hypoxemia. Thirty sex- and age-matched healthy individuals were recruited at the same time, from the same geographic region. Patients were part of a clinical trial (REBEC: U1111-1250-1843) but samples were obtained before any study intervention, within 24 hours from diagnosis confirmation. Circulating levels of angiogenesis/EB regulation mediators and coagulation biomarkers were measured by commercial assays (immunological or functional). Monolayers of endothelial cells from umbilical veins (HUVECs) or lung (HULECs) were used for measurement of EB integrity using an impedance sensor system (ECIS, Electric Cell-substrate Impedance Sensing System). Cells were stimulated with serum from patients or healthy individuals and EB integrity was continuously monitored for 36 hours. Clinical outcomes were obtained from the digital medical records. Results: mean length of hospital stay (LOS) was 12.9 ± 9.8 days. Twelve patients (40%) required intensive care (ICU) and 28/30 patients survived. Mean D-dimer was 3,609 ± 14,440 ng/mL. Circulating levels of Ang1, Ang2, sTie2 and VEGF-A were all significantly increased in patients compared to healthy individuals (Ang1: 463.2 ± 194.6 vs 237.4 ± 104.9 pg/mL, p<0.0001;Ang2: 1,926 (1,275 - 3,134) vs 1,215 (9 - 1,440 pg/mL), p<0.0001;Tie2: 10,753 ± 2,377 vs 8,603 ± 1,851 pg/mL, p<0.0001 and VEGF-A: 94.7 (73.4 - 116.0) vs 45.9 (39.7 - 57.0 pg/mL), p<0.0001.). In contrast, soluble VE-cadherin levels were decreased in patients compared to healthy individuals (1,234 ± 318 vs 1,539 ± 363 ng/mL, P=0.001). Serum from COVID-19 patients induced decreases of EB integrity in monolayers of both HUVECs and HULECs as early as 15 minutes, lasting up to 5 hours after stimulation (figure 1). The magnitude of EB disruption was correlated with clinically relevant outcomes such as time of ICU stay and LOS (figure 1). Interestingly, levels of Ang1, Ang2 and soluble VE-cadherin levels were also significantly correlated with the magnitude of EB disruption, as well as with biomarkers of coagulation activation such as fibrinogen, Von Willebrand Factor antigen levels, PAI-1, P-selectin and urokinase receptor (uPAR). Conclusions: Ang-1/Ang-2 mediated Tie2 signaling has been shown to be important for the fine regulation of barrier integrity and coagulation activation at the endothelial level, which are two critical elements of immunothrombosis. Our results provide evidence supporting that the interplay between these processes can play a role in the mechanisms driving COVID-19 severity, and suggest that targeting the Ang/Tie2 and VEGF-A pathways could be attractive strategies to modulate not only changes of the alveolar-capillary barrier, but also of coagulation activation in COVID-19. Figure 1. In (a), endothelial barrier (EB) integrity of HUVEC monolayers upon stimulation by serum from COVID-19 patients and healthy individuals (n=27-30 per group). The lower the normalized resistance, the higher the magnitude of EB disruption. Significant differences (* to ****) are evident from 15 min to 5 hours (An va corrected for multiple comparisons). In the lower panels, the correlation of EB disruption with clinically relevant outcomes such as length of hospital stay (b) and days of intensive care (c) are shown. Negative correlations (Spearman test) indicate that the magnitude of EB disruption is associated with worse outcomes. [Formula presented] Disclosures: No relevant conflicts of interest to declare.

Circulating levels of platelet, endothelial and red blood cell microvesicles in COVID-19: Association with biomarkers of coagulation, fibrinolysis and angiogenesis

Background: Hemostasis activation is a hallmark of COVID-19, and an integral part of a broader host response known as immunothrombosis. Microvesicles (MVs) are lipid-bilayer particles released from cells, and thought to be relevant mediators of immunothrombosis, due to their capacity to transfer proteins such as tissue factor (TF) and fibrinolytic mediators between different cells. Aims: To quantify platelet, endothelial cell (EC) and red blood cell (RBC) MVs in plasma from patients with COVID-19 and to explore their association with immunothrombosis mediators. Methods: Samples were obtained from patients admitted to a COVID-19 ward as part of a clinical trial. Samples were collected at admission, before any study intervention. MVs levels were measured in double centrifuged platelet poor plasma by flow cytometry. Coagulation, fibrinolysis and endothelial activation markers were measured by functional or immunological methods. The study was approved by the IRB and all participants provided written informed consent. Results: Data were obtained from 30 patients and 30 age and sexmatched healthy individuals. Mean time from symptoms onset and length of hospital stay (LOS) were 8.1 ± 2.3 days and 12.9 ± 9.8 days respectively. Twelve patients (40%) required intensive care (ICU), and 28/30 patients survived. Mean D-dimer was 3,609 ± 14,440 ng/mL. Platelet, EC and RBC MV counts are shown in Table 1. No association was observed between MV counts and clinical markers of disease severity such as LOS (total or in ICU), oximetry, and lung CT extension score. Associations between MV counts and biomarkers of coagulation, fibrinolysis and EC activation are shown in Table 2. Conclusions: Increased levels of MV from platelets and EC were observed in COVID-19. The association of these MVs with markers of coagulation and fibrinolytic activation, and with elements of the Tie2/Ang1 pathway warrant additional studies on the contribution of these pathways to the pathogenesis of COVID-19.

Association of the angiopoietin/TIE2 and VEGF-a pathways with clinical and laboratory markers of disease severity incovid-19

Background : Endothelial barrier (EB) disruption is an important part of immunothrombosis, allowing the access of leukocytes to inflamed tissues. Pathways involving angiopoietin (Ang) 1 and 2 and their receptor Tie2, and VEGF-A/VE-cadherin (VEC) are key regulators of EB integrity. While the association of these mediators with sepsis severity have been known for more than 15 years, it was only recently that their role in coagulation activation was described. Moreover, these proteins also mediate angiogenesis, which has been shown to be upregulated in COVID-19. Aims : To measure circulating levels of key mediators of Ang/Tie2 and VEGF-A pathways in COVID-19 patients, and to explore their association with disease severity and hemostatic activation. Methods : Samples were obtained from patients admitted to a COVID-19 ward, within 24 h from COVID-19 confirmation. EB mediator levels were measured by immunological methods (Elisa or multiplex assays). The study was approved by the IRB and all participants provided written informed consent. Results : Data were obtained from 30 patients and 30 age and sexmatched healthy individuals. Mean length of hospital stay (LOS) was 12.9 ± 9.8 days respectively, twelve patients (40%) required intensive care (ICU), and 28/30 patients survived. Mean D-dimer was 3,609 ± 14,440 ng/mL. Levels of EB mediators are shown in Table 1. Associations between these parameters with relevant clinical and laboratory markers of disease severity are shown in Table 2. Conclusions : All mediators of EB disruption were significantly elevated in COVID-19 patients. In addition, these mediators were consistently associated with proteins involved in immunothrombosis, in particular with fibrinogen, VWF:Ag, uPAR, PAI-1 and P-selectin. Clinically significant associations were observed between Ang-2 and VEGF-A and extension of lung disease (for both) and ICU stay (for VEGF-A). Additional studies are warranted to explore the crosstalk between Ang/Tie2 and VEGF-A pathways with hemostasis in COVID-19.